中国荷斯坦种公牛BLAD遗传缺陷的分子检测及系谱分析

本试验运用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（RFLP-PCR）方法,检测我国荷斯坦种公牛白细胞粘附缺陷（bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD）基因的携带频率。共检测了来自全国14个公牛站的587头种公牛,发现BLAD携带者8头,携带率为1.36%。对现有公牛系谱信息分析显示,携带者公牛来自美国、加拿大和中国,其中6头携带者公牛可以追溯到共同祖先Osborndale Ivanhoe。此外,本研究还对我国荷斯坦牛遗传缺陷的控制和携带者公牛的利用提出建议。     

木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因(Xyn B)的克隆

采用富集培养、透明圈平板筛选的方法,从长期堆放青贮饲料的土壤中分离到7株木聚糖酶产生菌。选取透明圈最大的木聚糖酶产生菌X7作为基础菌,对其进行16S rRNA部分序列PCR扩增测定,经BLAST同源性分析确定X7为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain GD3b(Genebank编码:HM055602.1)。然后设计特异引物,以X7基因组为模板,对其进行Xyn B基因序列PCR扩增,扩增产物经BLAST同源性分析表明已成功克隆了X7菌株的Xyn B基因,为日后构建木聚糖酶基因酵母表达载体,培育能够分泌表达具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基础。     

草地对全球气候变化的响应及其碳汇潜势研究

 本研究用综合顺序分类法（ＣＳＣＳ）分析了１９５０－２０００年和２００１－２０５０年期间的草原类型演替及碳汇动态。证明中国草地的碳汇主体依次是冻原和高山草地、温带湿润草地、斯泰普草地和半荒漠草地大类,占中国潜在草地总面积的８５．５２％,年碳汇潜力占中国潜在草地年碳汇潜力的９３．２９％。全球草地的碳汇主体是萨王纳、冻原和高山草地大类,两者的面积和占全球潜在草地总面积的４８．５０％,年碳汇潜力占全球潜在草地年碳汇潜力的７２．２２％。在全球气候暖干化的强（Ａ２ａ）、弱（Ｂ２ａ）情景下,与当前（１９５０－２０００年）情景相比,中国将呈现草地面积减少,林地面积增加的态势;与中国的趋势相反,全球将呈现草地面积增加,林地面积减少的态势。在全球暖干化的Ａ２ａ和Ｂ２ａ模式下,草地年碳汇潜力,中国将分别提升１４．６％和１８．５％,全球将分别提升１７．３％ 和１６．８％。但两者的增长方式不同,全球是以温带湿润草地大类年碳汇潜力大幅增加为特征,而中国是以负增长为特征。我国的暖干化趋势在草地年碳汇潜力上的反映较之全球更强烈。尽管造成全球气候暖干化的自然因素远非人力所能控制,但系统问题只能靠系统综合的办法治理。这是草地工作者当前的使命。     

多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化

 在前期克隆获得Lp5CS基因的全长ｃＤＮＡ 序列基础上,采用ＰＣＲ 扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因p5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点序列设计一对引物,使用Ｐｆｕ高保真ＤＮＡ 聚合酶和超级感受态细胞ＤＭＴ,通过ＰＣＲ 扩增,获得含有所要突变位点的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ,定向克隆入真核表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００中,转化拟南芥验证基因功能。结果表明,预期位点上发生了突变,Lp5CS编码的第１２８位密码子已由苯丙氨酸残基（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ,简称Ｐｈｅ或Ｆ）变为丙氨酸残基（Ａｌａｎｉｎｅ,Ａｌａ）,证明用ＰＣＲ 技术已成功地使Lp5CS基因发生定点突变。转基因拟南芥Ｔ１ 代植株进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测,获得４个转基因阳性株系。拟南芥Ｔ２代植株经１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理７ｄ后,转基因株系脯氨酸含量分别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ,显著高于野生型株系的２５８１μｇ／ｇＦＷ。说明转基因株系能积累更多地脯氨酸。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建

为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT-PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM-T Easy中得到重组克隆质粒pGEM-T-VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamHⅠ、XholⅠ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM-T-2VP1,然后将双拷贝VP1基因亚克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-2VP1。结果表明:得到了含有目的基因的阳性克隆。说明Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因原核表达质粒构建成功。     

蒙古羊Hoxc8基因甲基化与胸椎数量的关系

为了研究蒙古羊Hoxc8基因的甲基化与胸椎数的关系,试验采用亚硫酸氢盐测序PCR方法进行检测。结果表明:蒙古羊的14枚胸椎个体(T14)占26.1%,7枚腰椎个体(L7)占69.5%,其中Hoxc8 exon-1含27个CpG。T13型个体的甲基化CpG分别为6,3,6;T14型个体的甲基化CpG分别为23,20,21。T13和T14的甲基化比例平均值分别为(18.500±0.064)%和(79.030±0.056)%(P=0.002)。T14蒙古羊Hoxc8 exon-1的甲基化功能区(120～142个碱基)的CpG胞嘧啶全部甲基化,而T13则相反。说明蒙古羊Hoxc8 exon-1甲基化CpG的密度和数量影响Hoxc8基因的表达,并且调控胸椎的发育。     

禽呼肠孤病毒RT—LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠孤病毒（Aviem reovirus,ARV）S1基因序列设计了特异对应靶序列中的6个基因区段的4条引物,以此建立了一种快速、准确的ARV逆转录环介导等温扩增（RT—LAMP）检测方法,并对此方法的反应条件进行了优化。结果表明,该方法能够特异地扩增ARV,而对其他常见的禽类病毒均无扩增作用,特异性强、重复性好;检测ARV的灵敏度为4ELD50,是RT-PCR方法的10倍;在反应产物中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。     

光滑爪蟾抗菌肽的分离纯化和对癌细胞的生长抑制作用

通过凝胶过滤层析及高效液相色谱法,从皮肤分泌物中分离出具有抑菌活性的物质,即光滑爪蟾抗菌肽。以大肠癌细胞为体外实验模型,通过细胞形态学、MTS试验,研究光滑爪蟾抗菌肽对SW480细胞的杀伤和生长抑制作用。结果表明,经过分离纯化,得到较纯的活性物质,即光滑爪蟾抗菌肽。通过细胞形态学观察,光滑爪蟾抗菌肽作用组中,细胞的数量明显减少,细胞明显皱缩,成圆形,细胞间隙增大,死细胞增多。MTS试验表明,光滑爪蟾抗菌肽对SW480的生长抑制作用随着浓度的增加而加强。     

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定

对广东地区疑似发生鸽新城疫感染的鸽病料进行病毒分离,通过血凝试验(HA)、中和试验、F基因扩增及序列测定.结果分离到1株血凝效价为4log2,且能被NDV阳性血清中和的病毒;用针对NDV F基因设计的特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出相应的目的片段;测序及Blast分析表 明其与山东分离株chicken/...